O ditiotreitol (DTT) é um agente redutor comumente usado, também conhecido como o novo aditivo verde.É um composto orgânico molecular pequeno com dois grupos mercaptanos (-SH).Devido às suas propriedades redutoras e estabilidade, o DTT é amplamente utilizado em experimentos de bioquímica e biologia molecular.
O principal papel do DTT é reduzir as ligações dissulfeto em proteínas e outras biomoléculas.A ligação dissulfeto é uma parte importante do enovelamento e estabilidade das proteínas, mas sob certas condições experimentais, como análise SDS-PAGE redutível, recombinação e enovelamento de proteínas, é necessário reduzir a ligação dissulfeto a dois grupos tiol para desvendar a estrutura espacial de a proteína.O DTT pode reagir com ligações dissulfeto para reduzi-las a grupos mercaptanos, abrindo assim a estrutura espacial da proteína e facilitando sua análise e manipulação.
O DTT também pode ser usado para proteger a atividade e estabilidade da enzima.Em algumas reações catalisadas por enzimas, a atividade da enzima pode ser reduzida pelo oxidante.O DTT pode reagir com oxidantes para reduzi-los a substâncias inofensivas, protegendo assim a atividade e a estabilidade da enzima.
Comparado aos agentes redutores tradicionais, como o β-mercaptoetanol (β-ME), o DTT é considerado um agente redutor mais seguro e estável.Não só é estável em solução aquosa, mas também mantém suas propriedades redutoras sob altas temperaturas e condições ácido-base.
A utilização da TDT é relativamente simples.Em geral, o DTT é dissolvido num tampão apropriado e depois adicionado ao sistema experimental.A concentração ideal de DTT precisa ser determinada de acordo com o experimento específico e é geralmente usada na faixa de 0,1-1mM.Concentrações mais baixas podem reduzir os efeitos adversos no crescimento celular e podem reduzir a citotoxicidade devido à superexpressão de proteínas alvo.Concentrações mais elevadas podem causar carga metabólica celular excessiva, afetando o crescimento celular e a eficiência de expressão.
A forma de determinar a concentração ideal pode ser avaliar o nível de expressão da proteína alvo através da realização de testes de indução de IPTG em diferentes concentrações.Testes de cultura em pequena escala podem ser realizados utilizando uma gama de concentrações de IPTG (por exemplo, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.) e o efeito de expressão em diferentes concentrações pode ser avaliado através da detecção do nível de expressão da proteína alvo (por exemplo, Western detecção de mancha ou fluorescência).De acordo com os resultados experimentais, a concentração com melhor efeito de expressão foi selecionada como a concentração ideal.
Além disso, você também pode consultar a literatura relevante ou a experiência de outros laboratórios para compreender a faixa de concentração de IPTG comumente usada sob condições experimentais semelhantes e, em seguida, otimizar e ajustar de acordo com as necessidades experimentais.
É importante notar que a concentração ideal pode variar dependendo dos diferentes sistemas de expressão, proteínas alvo e condições experimentais, por isso é melhor otimizar caso a caso.
Em resumo, o DTT é um agente redutor comumente usado que pode ser usado para reduzir ligações dissulfeto em proteínas e outras biomoléculas e para proteger a atividade e estabilidade da enzima.Tem sido amplamente utilizado em experimentos de bioquímica e biologia molecular.
Horário da postagem: 28 de setembro de 2023