O IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) é um análogo do substrato da β-galactosidase, altamente induzível. Sob a indução do IPTG, o indutor forma um complexo com a proteína repressora, alterando sua conformação e impedindo sua ligação ao gene alvo, o que resulta na expressão eficiente deste. Portanto, como determinar a concentração de IPTG durante o experimento? Quanto maior a concentração, melhor?
Primeiramente, vamos entender o princípio da indução por IPTG: o operon da lactose da *E. coli* (elemento) contém três genes estruturais, Z, Y e A, que codificam, respectivamente, β-galactosidase, permease e acetiltransferase. O gene *lacZ* hidrolisa a lactose em glicose e galactose, ou em alolactose; o gene *lacY* permite que a lactose do meio externo atravesse a membrana celular e entre na célula; o gene *lacA* transfere o grupo acetil da acetil-CoA para a β-galactosidase, removendo o efeito tóxico. Além disso, há uma sequência operadora O, uma sequência iniciadora P e um gene regulador I. O gene I codifica uma proteína repressora que se liga à posição O da sequência operadora, reprimindo e desativando o operon (meta). Existe também um sítio de ligação para a proteína ativadora do gene catabólico (CAP) a montante da sequência iniciadora P. A sequência P, a sequência O e o sítio de ligação CAP constituem, em conjunto, a região regulatória do operon lac. Os genes que codificam as três enzimas são regulados pela mesma região regulatória para alcançar a expressão coordenada dos produtos gênicos.
Na ausência de lactose, o operon lac (meta) encontra-se em estado de repressão. Nesse momento, o repressor lac, expresso pela sequência I sob o controle da sequência promotora PI, liga-se à sequência O, impedindo a ligação da RNA polimerase à sequência P e inibindo o início da transcrição. Quando a lactose está presente, o operon lac (meta) pode ser induzido. Nesse sistema de operon (meta), o indutor real não é a lactose em si. A lactose entra na célula e é catalisada pela β-galactosidase, sendo convertida em alolactose. Esta última, como molécula indutora, liga-se à proteína repressora e altera sua conformação, o que leva à dissociação da proteína repressora da sequência O e à transcrição. O isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) tem o mesmo efeito que a alolactose. É um indutor muito potente, não metabolizado por bactérias e muito estável, sendo, portanto, amplamente utilizado em laboratórios.
Como determinar a concentração ideal de IPTG? Tomemos a E. coli como exemplo.
A cepa geneticamente modificada de E. coli BL21 contendo o plasmídeo recombinante positivo pGEX (CGRP/msCT) foi inoculada em meio líquido LB contendo 50 μg·mL⁻¹ de ampicilina e cultivada durante a noite a 37 °C. Essa cultura foi inoculada em 10 frascos contendo 50 mL de meio líquido LB fresco, também contendo 50 μg·mL⁻¹ de ampicilina, na proporção de 1:100, para expansão. Quando a densidade óptica (DO₆₀₀) atingiu 0,6 a 0,8, adicionou-se IPTG até atingir a concentração final de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 e 1,0 mmol·L⁻¹. Após a indução à mesma temperatura e ao mesmo tempo, 1 mL da solução bacteriana foi retirado e as células bacterianas foram coletadas por centrifugação e submetidas a SDS-PAGE para analisar a influência de diferentes concentrações de IPTG na expressão proteica, selecionando-se então a concentração de IPTG com a maior expressão proteica.
Após experimentos, constatou-se que a concentração ideal de IPTG não deve ser a mais alta possível. Isso ocorre porque o IPTG possui certa toxicidade para as bactérias. Exceder a concentração recomendada pode levar à morte celular; e, de modo geral, o ideal é que quanto maior a quantidade de proteína solúvel expressa na célula, melhor, mas em muitos casos, quando a concentração de IPTG é muito alta, ocorre a formação de uma grande quantidade de agregados, resultando na diminuição da quantidade de proteína solúvel. Portanto, a concentração ideal de IPTG geralmente não é a maior, mas sim a menor.
O objetivo da indução e do cultivo de linhagens geneticamente modificadas é aumentar o rendimento da proteína alvo e reduzir custos. A expressão do gene alvo é afetada não apenas por fatores intrínsecos da linhagem e do plasmídeo de expressão, mas também por outras condições externas, como a concentração do indutor, a temperatura e o tempo de indução. Portanto, em geral, antes de expressar e purificar uma proteína desconhecida, é recomendável estudar o tempo, a temperatura e a concentração de IPTG durante a indução, a fim de selecionar as condições adequadas e obter os melhores resultados experimentais.
Data da publicação: 31 de dezembro de 2021