Existem muitos heróis anônimos ao nosso redor, que parecem pessoas comuns, mas na verdade contribuem silenciosamente muito para o nosso bem-estar. A proteinase K é um desses "heróis anônimos" na indústria de diagnóstico molecular. Comparada aos grandes nomes do setor, a proteinase K é tão discreta que sua importância foi negligenciada por muito tempo. Com o surto da pandemia de COVID-19, a demanda por proteinase K disparou, e a oferta, tanto nacional quanto internacional, ficou muito aquém do consumo. Foi então que todos perceberam a importância crucial da proteinase K.
Qual a utilidade da proteinase K?
A proteinase K é uma serina protease com atividade enzimática proteolítica, capaz de manter sua atividade em uma ampla gama de ambientes (pH 4-12,5, tampão com alta concentração de sal, temperatura elevada de 70 °C, etc.). Além disso, a atividade da proteinase K não é inibida por SDS, ureia, EDTA, cloridrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, etc., e uma certa quantidade de detergente pode até mesmo potencializar sua atividade. A proteinase K possui diversas aplicações em tratamentos médicos (desinfecção de vírus e microrganismos), alimentos (amaciamento de carnes), couro (amaciamento de pelos), vinificação (clarificação de álcool), preparação de aminoácidos (degradação de penas), extração de ácidos nucleicos, hibridização in situ, entre outros. A aplicação mais comum é a extração de ácidos nucleicos.
A proteinase K pode enzimolisar todos os tipos de proteínas na amostra, incluindo as histonas fortemente ligadas aos ácidos nucleicos, permitindo que estes sejam liberados da amostra para o extrato, facilitando a próxima etapa de extração e purificação. Na detecção de ácidos nucleicos virais, a proteinase K é um dos componentes importantes na solução de amostragem viral. A proteinase K pode romper e inativar a proteína do capsídeo viral, o que é mais seguro durante o transporte e a detecção; além disso, a proteinase K também degrada a RNase, prevenindo a degradação do RNA viral e facilitando a detecção do ácido nucleico.
A fama repentina da proteinase K
Seja no campo da pesquisa científica ou no campo do diagnóstico in vitro (IVD), a extração de ácidos nucleicos é o experimento mais básico, portanto, a proteinase K sempre teve um papel fundamental. No entanto, no passado, a proteinase K era muito menos conhecida do que seu papel. Grande parte disso se devia à estabilidade da relação entre oferta e demanda da proteinase K. Poucas pessoas imaginavam que o fornecimento da proteinase K pudesse ser um problema.
Com o surto da epidemia do novo coronavírus, a demanda por testes de ácido nucleico aumentou drasticamente. No final de junho de 2020, a China havia realizado quase 90 milhões de testes para o novo coronavírus, e esse número é ainda mais alarmante em escala global. Em experimentos de extração de ácido nucleico, a concentração de trabalho da proteinase K é de cerca de 50 a 200 μg/mL. Geralmente, são necessários cerca de 100 μg de proteinase K para extrair uma amostra de ácido nucleico. Na prática, para aumentar a eficiência da extração de ácido nucleico, a quantidade de proteinase K utilizada costuma ser maior. A detecção de ácido nucleico do novo coronavírus gerou uma grande demanda por proteinase K. O equilíbrio entre oferta e demanda foi rapidamente rompido, e a proteinase K tornou-se, da noite para o dia, um importante material para a prevenção da epidemia.
Dificuldades na produção de proteinase K
Embora o desenvolvimento da epidemia tenha reconhecido a importância da proteinase K, é lamentável que, devido à sua baixa popularidade, poucas empresas nacionais se dediquem à sua produção. Ao tentar estabelecer a produção de proteinase K, descobriu-se, durante o processo produtivo, que se trata de uma proteína extremamente especial. Expandir a capacidade de produção de proteinase K em um curto período de tempo representa um grande desafio.
A produção em larga escala de proteinase K enfrenta as seguintes dificuldades.
1. Baixa expressão
A proteinase K pode degradar a maioria das proteínas de forma não específica e causar toxicidade grave à célula hospedeira de expressão. Portanto, o nível de expressão da proteinase K é geralmente muito baixo. A seleção de sistemas de expressão e linhagens que expressam altos níveis de proteinase K geralmente requer um ciclo mais longo.
2. Resíduos de pigmentos e ácidos nucleicos
A fermentação em larga escala introduz uma grande quantidade de resíduos de pigmentos e ácidos nucleicos da planta hospedeira. É difícil remover essas impurezas com um processo de purificação simples, e a purificação complexa aumenta o custo e reduz a taxa de recuperação.
3. Instabilidade
A proteinase K não é suficientemente estável, podendo sofrer auto-enzimólise, e é difícil armazená-la de forma estável a 37°C por um longo período sem um agente protetor.
4. Fácil de precipitar
Ao preparar o pó liofilizado de proteinase K, para garantir um alto teor de sólidos da enzima no pó liofilizado, é necessário adicionar um agente protetor de liofilização em alta concentração. No entanto, quando a concentração de proteinase K atinge 20 mg/mL ou mais, ocorre facilmente a agregação e a formação de um precipitado, o que dificulta bastante a liofilização de proteinase K com alto teor de sólidos.
5. Grande investimento
A proteinase K possui forte atividade proteolítica e pode hidrolisar outras proteases em laboratório. Portanto, a proteinase K requer áreas de produção, equipamentos e pessoal especializados para pesquisa, desenvolvimento e produção.
Solução de proteinase K da XD BIOCHEM
A XD BIOCHEM possui uma plataforma consolidada para expressão e purificação de proteínas, com vasta experiência na expressão e purificação de proteínas recombinantes e na otimização de processos de produção. Através da rápida formação de uma equipe de pesquisa e desenvolvimento, a empresa superou as dificuldades no processo de produção em larga escala da proteinase K. A produção mensal de pó liofilizado ultrapassa 30 kg. O produto apresenta desempenho estável, alta atividade enzimática específica e ausência de resíduos de citocromo e ácido nucleico da planta hospedeira. Entre em contato com a XD BIOCHEM e solicite um pacote de teste (E-mail:sales@xdbiochem.comTelefone: +86 513 81163739).
As soluções técnicas da XD BIOCHEM incluem
Utilizando a integração de plasmídeos multicópia, são selecionadas linhagens de alta expressão com um nível de expressão de 8 g/L, o que supera o problema do baixo nível de expressão da proteinase K.
Por meio do estabelecimento de um processo de purificação em múltiplas etapas, o citocromo hospedeiro e os resíduos de ácido nucleico da proteinase K foram removidos com sucesso, ficando abaixo do valor padrão.
Por meio de triagem de alto rendimento de formulações de tampão protetor, foi selecionado um tampão capaz de armazenar proteinase K de forma estável a 37°C.
A utilização de soluções tampão de triagem resolve o problema da facilidade com que a proteinase K se agrega e precipita em altas concentrações, e estabelece as bases para a liofilização da proteinase K com alto teor de sólidos.
Amostra de proteinase K XD BIOCHEM
Teste de estabilidade da proteinase K da XD BIOCHEM: não haverá alteração significativa na atividade após 80 dias à temperatura ambiente.
Teste de estabilidade da proteinase K da XD BIOCHEM: não haverá alteração significativa na atividade após 80 dias à temperatura ambiente.
Comparação do efeito de extração de ácido nucleico da proteinase K da XD BIOCHEM e de produtos concorrentes. No processo de extração de ácido nucleico, foram utilizadas a proteinase K da XD BIOCHEM e uma proteinase K concorrente. A eficiência de extração da proteinase K da XD BIOCHEM foi maior e o valor de Ct do gene alvo foi menor.
Data da publicação: 31 de dezembro de 2021